Клонирование ДНК

Векторные системы, обеспечивающие доставку чужеродного фрагмента ДНК в клетку хозяина, для прокариот и эукариот различны. Для клонирования в ...

Клонирование ДНК — использование технологии рекомбинантных ДНК для выделения и размножения определенной нуклеотидной последовательности, содержащейся в сложной смеси фрагментов ДНК. Для этой цели первоначально все фрагменты ДНК смеси внедряют в клонирующий вектор , затем с помощью скрининга отбирают среди них рекомбинантные молекулы, содержащие целевой фрагмент ДНК, напр. ген , а затем осуществляют их размножение путем введения отобранной рекомбинантной ДНК в подходящую клетку-хозяина, напр. в клетку кишечной палочки.

Клонирование ДНК  включает 6 этапов:

1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции;

2) рекомбинация фрагментов,

3) вставка фрагмента ДНК в вектор;

4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;

5) скрининг на рекомбинантный вектор

6) отбор интересующих исследователя клонов.

Рестрикционные ферменты. Рестриктазы. Эндонуклеазы.

В каждой хромосоме человека имеется только одна непрерывная нить ДНК. Она сложно упакована для того, чтобы поместиться в хромосоме. Манипулировать с молекулой ДНК такой длины практически невозможно.

Поэтому открытие в 70-х годах XX в. особых бактериальных ферментов. разрезающих ДНК на отдельные фрагменты, было очень кстати. Ферменты были названы рестриктазами или эндонуклеазами.

У бактерий эти ферменты служат для защиты от проникновения в клетку чужеродной ДНК. Обычно рестриктазы распознают так называемые палиндромные последовательности нуклеотидов, наблюдающиеся в двух нитях ДНК и состоящие из 4—6 нуклеотидов.

«Палиндромные » означает одинаковые последовательности нуклеотидов, если их читать в одном и том же направлении, например от 5'- к 3'-концу в обеих комплементарных нитях ДНК.

 Генная инженерия

Методы клонирования ДНК

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить.

Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.

Клонирование ДНК in vivo

Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую .

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика », так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.

Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК .

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.

Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг . Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.

Подготовка ДНК к клонированию [О.В.Мосин]

Рестрикция— лигирование

В классических методиках рестрикции и лигирования, клонирование фрагмента ДНК включает четыре стадии: разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции. лигирование ДНК с вектором. трансфекция и последующий скрининг .

Выделение вставки

Первоначально необходимо выделить участок ДНК для клонирования. Часто препарат ДНК для клонирования получают при помощи полимеразной цепной реакции. а также разрезания ДНК рестриктазами. обработкой ДНК ультразвуком. фракционированием при помощи агарозного электрофореза ДНК. Выделение вставки может быть сделано технологией клонирования шотган, комплементарной ДНК. искусственным химическим синтезом.

Трансформация

После лигирования плазмидой трансформируют бактерии для наращивания. Бактерии далее выращивают на селективной среде для отбора колоний, содержащих встройку. Индивидуальные колонии отбирают и изучают на наличие встройки.

Трансфекция

После лигирования реакционную смесь со встроенным в требуемой ориентации вектором помещают в клетки. В зависимости от типа клеток используют химическую сенситизацию клеток, электропорацию или генные пушки. Для химической сенситизации не требуется специальное оборудование. Электропорацию используют в случае необходимости высокой эффективности трансфекции. Генные пушки применяют в случае растительных клеток и тканей, так как клеточная стенка растений не дает чужеродной ДНК проникать в цитоплазму и ядро.

Получают культуры трансфецированных клеток. Так как описанные выше процедуры часто имеют низкую эффективность, требуются способы выявления клеток, содержащих требуемую вставку в правильной ориентации и отделение таких клеток от не содержащих вставки. Современные векторы для клонирования содержат селективные маркеры которые дают возможность расти только клеткам с правильной вставкой расти на селективной среде . Векторы для клонирования также часто содержат маркеры, обуславливающие окраску колоний, например при выращивании на среде, содержащей X-gal. Для точного подтверждения успешного клонирования, требуется проверка при помощи полимеразной цепной реакции , полиморфизма длин рестрикционных фрагментов или секвенирования ДНК .

Генная терапия

Генная терапия подразумевает введение работающего гена в клетки, в которых он отсутствует, что приводит к излечению болезни, связанной с отсутствием или неправильным функционированием гена. Генную терапию классифицируют на две категории. В первом случае мутации содержатся в стволовых или половых клетках, тогда весь организм и все потомки имеют дефект. Во втором случае мутация возникает в соматических клетках. возможна пересадка модифицированных клеток или тканей. Клинические испытания генной терапии соматическими клетками начались в конце 1990-х, для лечения рака крови, печени и легких.

Клонирование ДНК

Клонирование ДНК — процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий in vitro . Клонирование ДНК часто применяют для амплификации фрагментов, содержащих гены. а также любые другие последовательности— например, промоторы. некодирующие последовательности. химически синтезированные олигонуклеотиды и случайные участки ДНК.

Источники: humbio.ru, dommedika.com, www.biotechnolog.ru, dic.academic.ru, ru.rfwiki.org

Хаусдорф

Величие Колизея

Музеи Пушкина в Москве

Тайна психометрии – Жерар Круазе

Колонизация Марса

Энергосбережение - светодиодное освещение

Сегодня на рынке основные виды энергосберегающего освещения представлены люминесцентными лампами типа КЛЛ и светодиодными светильниками. Люминесцентная энергосберегающая лампа мощностью 20 ...


Медведицкая гряда

Одной из крупнейших аномальных зон в России является Медведицкая гряда. Она находится на границе Саратовской и Волгоградской областей и ...


Лицо на Марсе

Планета Марс не случайно является объектом пристального внимания ведущих государств. Не секрет, что проекты пилотируемых экспедиций уже давно перешли ...


NASA World Wind

Специалисты NASA времени не теряли и по придуманному нами принципу запустили два исследовательских спутника. Двигаясь по орбите Земли вокруг ...


Храмовники

Храмовники Северной Африки насчитывают около полумиллиона человек, и их общество имеет филиалы в Соединен­ных Штатах, Мексике, Канаде и Панаме. Они ...


Небесный учитель

Предания индейцев хопи об учителях с небес не одиноки. Индейцы каяпо из верховьев Амазонки хранят память о загадочном пришельце из космоса, ...


Что такое черная дыра в космосе

Черная дыра – один из самых загадочных объектов во Вселенной. О возможности существования черных дыр говорили многие известные ученые, ...


Как вести себя в женском коллективе

Часто женский коллектив сравнивают с клеткой, где хищники. В подобной среде не всегда можно работать спокойно, ведь львиная доля ...


Тайна озер

Существует множество озер, тайны которых до сих пор не раскрыты даже в малой степени. К  ним относится Ложное озеро или озеро ...